Валерий Сергеевич Золотухин родился в селе Быстрый Исток Быстроистокского района Алтайского края в семье председателя колхоза. В семь лет после травмы колена и неправильно оказанной первичной медицинской помощи мальчик чуть не стал инвалидом. Золотухину поставили диагноз туберкулез кости и объявили, что он никогда не будет ходить самостоятельно. Валерию Золотухину пришлось нелегко: до восьмого класса он ходил на костылях и, не смотря на болезнь, мечтал стать артистом. Валерий Сергеевич вспоминал: "У меня всегда было чувство счастливой уверенности в себе, я даже допустить не мог, что не достигну задуманного. А мечтал я ни много, ни мало, а стать артистом. Я же не понимал тогда, что с моей травмой это невозможно, потому, наверное, и добился своего".
По окончании школы с золотой медалью он отправился в Москву поступать на отделение музыкальной комедии ГИТИСа и успешно прошел все испытания. Учебой был увлечен, занимался с азартом, стремясь постичь все таинства актерской профессии.
В 1963 г. В. С. Золотухин окончил театральный институт, и был приглашен в Театр им. Моссовета, где проработал год, а затем, перешел в Московский театр драмы и комедии на Таганке. Этот театр стал его судьбой: «Таганке» он остался верен на всю жизнь. С октября 2011 по март 2013 г. Валерий Сергеевич был художественным руководителем Театра на Таганке.
Первое приглашение В. Золотухину сняться в кино последовало от режиссера В. Назарова. Дебютный для молодого артиста историко-приключенческий фильм "Пакет" по одноименной повести Л. Пантелеева вышел на экраны в 1965 г. Роль Трофимова принесла Золотухину первую известность в 1965 году.
С конца 1960-х актёр активно снимался в кино, наибольшую известность получило исполнение роли участкового Серёжкина в трилогии "Хозяин тайги" (1969), "Пропажа свидетеля" (1971) и "Предварительное расследование" (1973); а также в фильмах "Бумбараш" (1972), "Сказ про то, как царь Пётр арапа женил" (1976).
С 2003 года был художественным руководителем Государственного молодёжного театра Алтая.
2 декабря 2007 года был избран депутатом ГД 5 созыва по списку партии "Справедливая Россия", однако до вступления в должность, 14 декабря передал мандат Константину Бесчетному.
В 2009 анимировал одного из главных героев мультфильма "9".
18 июля 2011 года назначен директором Театра на Таганке со сроком полномочий до 15 октября. Этот срок был определён самим Золотухиным. Одновременно он исполняет обязанности художественного руководителя театра. В октябре 2011 года срок полномочий продлён на год, до 15 октября 2012 года.
Автор нескольких книг воспоминаний, в том числе о Владимире Высоцком.